0 引言
大肠杆菌，台甫大肠埃希氏菌，是人和动物肠路中最重要且数量最多的一种细菌，重要寄生在大肠内 。若此菌在水和食品中检出，可能是由于粪便传染，暗示其中可能有肠路病原菌，因而，对大肠杆菌的检测常作为沉要卫生学尺度之一 。此表，部门致病性大肠杆菌侵入人体后可引起习染，有关食品中存在大肠杆菌导致人员中毒的景象层出不穷，如2013年在云南曾暴发因冷冻肉习染大肠杆菌而导致人员中毒事务2016年食堂工作人员携带非典型致病性大肠杆菌所造成食品传染导致26名幼学生食源性疾病暴发事务 。国表也同样出现了大肠杆菌风险食品安全的景象 。1982—2002年美国曾有多例食源性大肠杆菌传染事务产生，其中有7例与乳制品有关 。乳制品中大肠菌群的传染占有很大比例，在2016—2018年和2019年前三季度我国乳制品微生物项目监督抽检中，大肠菌群超标最为严沉，其中发酵乳占有很大的比例 。大肠杆菌拥有肯定的耐酸性，酸奶及乳饮料被其传染可能会影响产品质量，风险人类食品安全，监测大肠杆菌在产品中的检出及变动情况至关沉要 。
因而，本文模仿出产中产品传染大肠杆菌的情况，向酸奶及乳饮猜中接种大肠杆菌，监控其在分歧pH、贮藏温度前提下，贮藏过程中菌含量变动及pH的变动情况，为现实出产加工过程中产品冷藏及脱冷前提下大肠杆菌的检验检测和产品质量节造提供理论凭据和理论领导 。
1 资料与步骤
1.1 资料
1.1.1 菌株
菌株为大肠埃希氏菌ATCC 25922 。
1.1.2 试剂
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、营养肉汤造就基；氯化钠 。
1.1.3 仪器与设备
BSC1500IIA2-X生物安全柜；FE28-TRIS pH计；HVM1涡旋仪；JJ1000A电子天平；BSP-250生化造就箱；MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌锅 。
1.2 步骤
1.2.1 菌种活化
取保留于-80℃冰箱中磁珠管中的大肠杆菌尺度菌株，取1粒磁珠转接至营养肉汤中，37℃造就24 h，活化三代后备用 。
1.2.2 样品造备
(1）样品中分歧浓度大肠杆菌在分歧贮藏温度下含量的变动
拔取酸奶（250 g/瓶），乳饮料（300 mL/瓶）各16瓶，先将活化后菌液（1.2.1）用无菌生理盐水梯度稀释至103 CFU/mL和105 CFU/mL两个梯度，再将稀释后菌液接种至酸奶、乳饮猜中使其菌含量约为10 CFU/mL和103 CFU/mL 。以上接种后样品别离贮藏于4℃和25℃两个温度前提下，定期测定样品中大肠杆菌含量变动 。
(2）接种大肠杆菌验证在分歧贮藏前提下含量变动
市售酸奶pH领域通常为4.2～4.5，乳饮料为3.0～4.0，本试验酸奶的初始pH为4.2，乳饮料为3.6，因而，别离调节酸奶及乳饮料的pH为4.2和3.6两个组，而后无菌操作向样品中接种大肠杆菌至样品中菌含量约为103 CFU/mL，别离贮藏于4℃和25℃前提下，测定样品中大肠杆菌含量变动及样品pH的变动情况 。凭据分歧的贮藏前提及pH分为以下四个组 。
表1 样品的pH及贮藏温度
(3）分歧pH营养肉汤对大肠杆菌含量的影响
在通常情况下营养肉汤造就基溶化后pH为7.5，本次试验调节初始营养肉汤造就基的pH别离为3.2,3.4,3.6,3.8,4.0,4.2,4.4,4.6,4.8，取1 mL大肠杆菌菌液别离接种到100 mL的营养肉汤管中，置于（36±1）℃造就箱中造就，定期测定大肠杆菌含量 。
1.2.3 大肠杆菌含量测定
本试验选取《GB 4789.3—2016食品安全国度尺度食品微生物学检验大肠菌群计数》中第二法测定样品中大肠杆菌含量 。
1.2.4 pH测定
选取校准后的pH计测定贮藏过程中酸奶及乳饮料及营养肉汤造就基的pH 。
2 了局与分析
2.1 酸奶及乳饮料中分歧浓度大肠杆菌贮藏后变动情况
通过向酸奶及乳饮猜中接种低（10 CFU/mL，高（103 CFU/mL）两个梯度的大肠杆菌，模仿现实出产中产品低温贮藏（4℃）及可能遇到的常温脱冷（25℃）的情况，探索酸奶及乳饮猜中大肠杆菌随功夫耽搁的含量变动情况 。了局如表2所示，乳饮料在分歧初始接菌量和分歧贮藏温度前提下，贮藏16天后菌含量均降低至无法检出 。酸奶样品贮藏在4℃仍还有大肠杆菌存活，且高梯度中渣滓量高达268 CFU/mL，但在25℃前提下贮藏，无论是接种高梯度还是低梯度的大肠杆菌，样品中大肠杆菌含量均降低至无法检出（表2） 。
造成以上差距的原因可能是由于温度合适，乳酸菌产生抗菌物质，或者乳酸菌发酵产酸导致样品pH降低 。从表中了局批注，大肠杆菌降低至无法检出的样品均为低pH的样品 。因而，低pH可能对大肠杆菌的活性造成较大的影响 。
2.2 分歧pH对酸奶中大肠杆菌的影响
基于2.1的了局，即酸奶和乳饮料在贮藏过程中大肠杆菌的存活情况分歧的景象，进一步对其原因进行探索 。经测定，酸奶初始pH为4.2 。由图1a中能够看出，随着贮藏功夫的增长，pH4.2的酸奶样品在25℃前提下贮藏pH不休降低，而在4℃前提下贮藏pH根基维持不变 。pH为3.6酸奶样品不论是在4℃和25℃贮藏pH根基维持不变 。
图1b显示出，贮藏过程中，A前提下的酸奶中大肠杆菌整体出现相对缓慢降低趋向，B,C,D前提下含量出现削减趋向，降低速度较快 。低pH酸奶（B,D）样品中菌均在贮藏4天后降低至无法检出，C前提下贮藏6天后降低至无法检出 。一样贮藏温度前提下，pH低的酸奶中大肠杆菌含量削减的更快，批注pH对大肠杆菌的活性造成了较大的影响 。当酸奶pH为4.2时，冷藏（4℃）前提下，大肠杆菌及乳酸菌活性均受到抑造，乳酸菌在贮藏过程中未进行显著的发酵产酸，酸奶在整个贮藏过程中pH根基不变，因而大肠杆菌降低速度缓慢，贮藏15天后仍有菌检出，为57 CFU/g，超启程酵乳三级采样最高安全限量值5 CFU/g，而在25℃贮藏的酸奶中乳酸菌在相对合适前提下，滋生发酵产酸，导致贮藏过程中酸奶pH显著降低至3.8，这可能对大肠杆菌产生了较大的影响，其降低速度显著高于低温贮藏的酸奶样品，但在这其中乳酸菌也可能造成了肯定的影响 。当酸奶pH为3.6时，分歧贮藏温度间降低速度相差不大，由此可见，pH对酸奶中大肠杆菌的影响更为显著 。
图1 酸奶在贮藏过程中的大肠杆菌菌含量（a）及pH(b）的变动情况
表2 分歧产品在分歧贮藏温度前提下大肠杆菌含量及pH的变动情况
2.3 分歧p H对乳饮猜中大肠杆菌的影响
乳饮料初始pH为3.6,A前提下贮藏的乳饮料pH根基不变，而25℃贮藏过程中pH降低，可降到3.4 。与酸奶分歧的是在pH 3.6的低pH下，25℃贮藏乳饮料的pH持续降低，这可能是由于酸奶与乳饮猜中乳酸菌菌种分歧造成的 。乳饮猜中为更耐酸性的菌种，乳酸菌持续发酵产酸导致pH持续降低 。（图2b）与酸奶一样，A前提下的乳饮猜中大肠杆菌含量先略有增长后降低，可能是由于大肠杆菌对低温拥有肯定的抗性，随功夫耽搁，不利于其成长，菌含量显著降低，其他前提下乳饮猜中的大肠杆菌含量随着贮藏功夫耽搁而削减，B、C、D前提下的乳饮料别离在贮藏10,6,4天后，大肠杆菌的量降低至无法检出，且样品pH别离为3.6,3.7,3.5，而A前提下的乳饮料直至贮藏15天后仍有菌存活，为28 CFU/mL 。图2a中能够看出，贮藏温度越高，pH低的乳饮猜中菌含量降低的越快 。贮藏温度及pH均对大肠杆菌的活性造成了肯定的影响 。
2.4 pH对大肠杆菌成长的影响验证
大肠杆菌对酸性拥有肯定的抗性，但相对更低的pH也会对大肠杆菌的活性造成影响 。有文件报路大肠杆菌最低造就温度为7℃左右，适合成长的最低pH为4左右 。表中为pH分歧的造就基中大肠杆菌在造就过程中的变动情况 。
当pH>3.8时，随着造就功夫的耽搁大肠杆菌成长滋生，菌含量增长，而当pH≤3.8时，随着造就功夫的耽搁大肠杆菌活性受到抑造，菌含量逐步降低，由此可见较低的pH对大肠杆菌造成了肯定的影响 。乳饮料的pH相对酸奶更低，因而，对大肠杆菌活性造成了抑造，加快了大肠杆菌的失活，低温前提下，正常乳饮料（pH 3.6）在贮藏6天后菌含量降低为2 CFU/mL，随功夫耽搁，第10天降低至无法检出，而酸奶（pH 4.2）在贮藏15天仍有菌检出（图1a，图2a） 。
3 了局与会商
产品中大肠菌群传染节造对于消费者的食品安全来说至关沉要，因而相识大肠杆菌传染产品后随着贮藏功夫及前提扭转的变动法规拥有沉大意思 。为了保险酸奶及乳饮料的品质，通常低温冷藏（4℃）保留，但当在出厂运输等过程中可能会出现脱冷的情况，因而钻研保质期内产品中习染大肠杆菌后的变动情况拥有沉要意思 。低pH显著加快大肠杆菌的衰亡，贮藏温度及pH均对产品造成了肯定的影响，但贮藏温度对产品中大肠杆菌的影响可能是由于温度升高产品中乳酸菌发酵，pH降低导致的 。当产品在运输、销售等过程中产生脱冷时，通常以为大肠杆菌可能滋生，发酵产酸产气导致产品胀包，然而本试验过程中，产品中大肠杆菌并未增长，25℃贮藏的酸奶及乳饮料在整个贮藏期间均未产生胀包景象，相反pH降低加快大肠杆菌的灭亡 。大肠杆菌在分歧pH造就基中的成长状态，再次证了然pH对大肠杆菌的影响 。这对于出产中现实检验检测拥有肯定的领导意思 。大肠菌群作为出产过程卫生批示菌，对其的节造极度沉要 。由于pH对大肠菌群的影响，检测制品可能并不能代表真实情况，必要实时进行检验检测 。因而，为了更好节造食品安全，对于酸奶类产品建议在发酵前或者制品灌装后实时检测 。
图2 乳饮料在贮藏过程中的菌含量（a）及pH(b）的变动情况
表3 pH分歧造就基中大肠杆菌随造就功夫耽搁的变动情况
